另一个漫画迷钟爱的角色─格温·史黛西─也在《蜘蛛侠3》中首次出现在大银幕。漫画迷们都很熟悉，格温·史黛西在1965年12月《The Amazing Spider-Man》第13集首度现身，并成为彼得·帕克的初恋。

《蜘蛛侠3》中，格温是个爱上蜘蛛侠的同班同学。她的出现，让彼得与真爱玛丽珍的关系产生新的变量。同时，格温也是艾迪·布洛克迷恋的对象，她的亲切态度意外让艾迪误以为两间有进一步发展的可能性。

这个角色由布莱丝·达拉斯·霍华德德演出。她说她的角色虽然在电影和漫画中不一样，但漫画对她将格温·史黛西带进大银幕仍有所启发。“在漫画中他们的关系很深远，而这些都成了我演出的基础，”演员说。“格温在电影里是个配角。但有很多的细节和暗示，埋藏在她和彼得的戏中。她不仅仅是彼得·帕克生活的一段插曲，而且是一个可能成为彼得好伴侣的人。因为她的父亲是个警官，所以她能更适应一个总是不在身边，而且每天都面临生命威胁的人。我可以用漫画所描绘的为基础，来诠释这个角色。”

制片劳拉·奇兹说，霍华德对于演出特技戏和雷米给她的任何挑战，都感到特别兴奋。“布莱丝前来和托比试读格温·史黛西的对白时，就完全征服我们了，”奇兹回忆。“她就像是一片黑暗中的阳光、一则故事中的戏剧性。而且她也像是个骑兵，完成我们要求她做的任何事，不论是吊在好几层高的大楼，或和蜘蛛侠一起在空中飞翔。她真是太棒了！”

曾获奥斯卡提名的詹姆斯·克姆威饰演关的父亲─纽约警官丘奇·史黛西。他在电影里通知彼得关于本叔叔之死的惊人新消息，并且担心着艾迪·布洛克对女儿的强烈兴趣。而泰瑞莎·罗素则饰演弗林特·马可分居的妻子─埃玛·马可。